Il gioco inizia con Chell che si sveglia in una piccola stanza di vetro che ha solo un letto, un bagno e una radio all'interno. Le viene detto da GLaDOS che presto inizieranno i test, e su una delle pareti si apre un portale arancione. Una volta che il giocatore lo attraversa, entra nelle stanze di prova e inizia il test. Ci sono 20 camere di prova, chiamate Camere di prova, in tutto.
I test iniziano in modo semplice. Chell deve prendere delle scatole, chiamate Weighted Storage Cubes (Cubi di stoccaggio pesati), e metterle su dei bottoni, che apriranno la porta all'uscita della camera. A questo punto, GLaDOS parla a Chell come guida, la loda e promette la sua torta quando i test sono finiti. Vicino all'inizio del gioco, Chell ottiene il dispositivo portatile Portal Device di Aperture Science, noto anche come Portal Gun. All'inizio, la sua Portal Gun realizza solo portali blu e i portali arancioni sono realizzati da GLaDOS. In seguito, Chell ottiene la Portal Gun completa e può realizzare sia i portali blu che quelli arancioni.
Le prove diventano sempre più pericolose sempre di più nel gioco. In alcune stanze c'è del veleno sul pavimento. In altre, ci sono sfere di elettricità chiamate High Energy Pellets, che uccidono Chell se le tocca. Durante questi test, il GLaDOS diventa sempre più sarcastico, dando a Chell consigli inutili, come "Il pavimento qui ti ucciderà". Cercate di evitarlo". A un certo punto, GLaDOS dice a Chell che una camera è rotta e che deve passare attraverso una camera piena di cannoni di sentinella, chiamata Torretta. Se una torretta vede Chell, le sparerà fino alla morte. In questa camera c'è una stanza nascosta. Nella stanza nascosta ci sono disegni e scritte sui muri lasciati da una persona sconosciuta. La scritta dice cose come "la torta è una bugia" e "lei sta sempre a guardare" con l'immagine di una macchina fotografica. Ci sono altre stanze come questa nelle camere successive.
In un'altra camera, Chell deve usare il Weighted Companion Cube, che sembra un Weighted Storage Cube con i cuori, per risolvere il test. Durante il test, GLaDOS dice più volte a Chell che il Companion Cube non è vivo, ma alla fine del test, dice a Chell che deve "uccidere" il Companion Cube per arrivare al test successivo.
Durante l'ultimo test, Chell deve stare in piedi su una piattaforma mobile. Alla fine della pista della piattaforma, la porterà in un pozzo di fuoco. GLaDOS ringrazia Chell per aver fatto i test. All'ultimo minuto, Chell usa la sua Portal Gun per sfuggire alla trappola. Mentre cerca di fuggire dall'edificio, Chell viene condotta in una stanza dove trova GLaDOS. Chell rompe una palla bianca che è caduta dal GLaDOS. GLaDOS le dice che è stata stupida a romperla perché non sapevano cosa fosse, ma GLaDOS capisce subito che si trattava del suo nucleo morale. Dice a Chell che le persone che lavoravano per Aperture Science l'hanno installato per farla smettere di ucciderli con la "neurotossina mortale". Poiché Chell l'ha rotto, GLaDOS può usare di nuovo la Neuro-Tossina. Chell ha un limite di tempo di 6 minuti per uccidere GLaDOS prima che la Neuro-Tossina uccida Chell. Dopo averne rotto dei pezzi e averli bruciati, il GLaDOS viene distrutto e Chell fugge dall'edificio.
Dopo la fuga di Chell, sviene e un robot la trascina di nuovo nell'edificio. Durante i titoli di coda, GLaDOS canta una canzone intitolata "Still Alive" scritta da Jonathan Coulton, che dice che anche se Chell l'ha uccisa, lei è ancora viva.
