Lynch ha trascorso quindici anni a
Chicago, recitando nella Steppenwolf Theatre Company e andando in tournée con il gruppo comico The Second City. Ha interpretato Carol Brady in
The Real Live Brady Bunch. Ha anche scritto e recitato nella premiata commedia
Oh Sister, My Sister.
Il suo ruolo cinematografico di svolta è stato quello di Christy Cummings, la cinofila lesbica butch della moglie trofeo Sheri Ann Cabot (Jennifer Coolidge) nel mockumentary Best in Show (2000) del regista Christopher Guest. È apparsa anche in A Mighty Wind (2003) di Guest nel ruolo della porno attrice diventata cantante folk Laurie Bohner e in For Your Consideration (2006) nel ruolo di una giornalista di spettacolo.
Lynch è anche un'attrice televisiva. Ha recitato con John Hannah e William Fichtner in MDs del 2002, e ha fatto apparizioni come ospite in molti show televisivi, tra cui L.A. Law, Judging Amy, The West Wing, 7th Heaven, Friends, Dawson's Creek, Felicity, Arrested Development, Lovespring International, Two and a Half Men, Weeds, Boston Legal, The L Word, Criminal Minds, Help Me Help You, Gilmore Girls, The New Adventuresof Old Christine, Psych, Monk e Party Down, tra gli altri.
Nel 2005, Lynch è stata nominata come una delle "10 Amazing Gay Women in Showbiz" di POWER UP.
Il pubblico e la critica hanno notato la Lynch per il suo ruolo bizzarro in The 40-Year-Old Virgin di Judd Apatow. Ha detto a Terry Gross di Fresh Air che il ruolo era originariamente previsto per un uomo ma, su sollecitazione della moglie di Steve Carell, Nancy Walls, è stato invece offerto alla Lynch. Da allora, ha recitato in una serie di film tra cui Role Models, Talladega Nights: The Ballad of Ricky Bobby, Alvin & the Chipmunks, Walk Hard: The Dewey Cox Story, Space Chimps, The Rocker, The Hammer, Another Cinderella Story, Ice Age: L'alba dei dinosauri e Spring Breakdown.
In Julie and Julia, ha interpretato il ruolo di Dorothy McWilliams, la sorella di Julia Child. Entertainment Weekly ha dedicato un articolo sul suo sito web alla possibilità che la sua performance riceva una nomination agli Oscar.
A partire dal 2009, Lynch è apparsa nello show della Fox Glee. Ha ottenuto recensioni entusiastiche per il suo ruolo dell'aggressiva allenatrice di cheerleader Sue Sylvester. Mary McNamara del LA Times ha scritto: "Lynch da sola rende Glee degno di essere guardato". Prima del suo lavoro con Glee, è stata una serie regolare nella commedia di Starz Party Down. Anche se la serie è stata rinnovata per una seconda stagione, Lynch non sarebbe tornata a causa del suo lavoro in Glee. Il 15 dicembre 2009, Lynch ha ricevuto una nomination ai Golden Globe come miglior attrice non protagonista in una serie, miniserie o film per la televisione per il suo ruolo in Glee. Ha perso contro Chloë Sevigny. La serie stessa ha anche ricevuto nomination in altre tre categorie. Il 29 agosto 2010, Lynch ha vinto il Primetime Emmy Award per Outstanding Supporting Actress - Comedy Series.
Lynch ha ospitato il Saturday Night Live il 9 ottobre 2010; la notizia del suo hosting le è stata accidentalmente rivelata dal suo capo di Glee, Ryan Murphy, tramite un messaggio di testo. Lynch ha anche recitato come guest star nello show Nickelodeon iCarly nel ruolo di Pam Puckett, la madre di Sam Puckett, nell'episodio iSam's Mom.
Lynch è apparso agli MTV Video Music Awards 2010 il 12 settembre 2010.
Nel gennaio 2011, Lynch è stata premiata con il Golden Globe nella categoria Migliore attrice non protagonista in una serie, miniserie o film per la televisione. Ha anche iniziato ad apparire negli annunci XFinity di Comcast che vengono mostrati sia su Internet che in televisione negli Stati Uniti, principalmente con due diversi computer portatili e due gatti persiani di colore diverso.
