Un enzima di restrizione è un enzima che taglia il DNA in punti particolari. Lavora su o vicino a specifiche sequenze nucleotidiche di riconoscimento note come "siti di restrizione". Per tagliare il DNA, tutti gli enzimi di restrizione fanno due incisioni, una per ogni filamento della doppia elica del DNA.
Questi enzimi si trovano nei batteri e negli archei e li difendono dai virus invasori, che sono batteriofagi.
All'interno di un procariote, gli enzimi di restrizione tagliano selettivamente il DNA estraneo in un processo chiamato restrizione. Il DNA ospite è protetto da un altro enzima che protegge il DNA ospite e blocca la scissione. Insieme, questi due processi costituiscono il sistema di modifica della restrizione. È il sistema immunitario più antico e semplice. Sono anche una specie di elemento genetico mobile ed egoista.
Più di 3000 enzimi di restrizione sono stati studiati in dettaglio, e più di 600 di questi sono disponibili in commercio. Questi enzimi sono usati abitualmente per la modifica del DNA nei laboratori, e sono uno strumento vitale nella clonazione molecolare.