Evoluzione diretta
L'evoluzione diretta (DE) è un metodo utilizzato per produrre enzimi per scopi industriali o medici.
Il metodo è l'ingegneria delle proteine che imita la selezione naturale.
L'idea di base è quella di sottoporre un gene a ripetuti cicli di mutazione, di fare una biblioteca di varianti. La selezione isola i geni con la funzione desiderata. Sono un modello per il prossimo ciclo.
Questo può essere fatto in vivo (in cellule viventi di batteri o lieviti), o in vitro (libero in soluzione o micro gocce).
Testando più mutanti si aumentano le possibilità di trovarne uno con le proprietà desiderate.
Durante l'evoluzione in vivo, ogni cellula (di solito batteri o lieviti) viene trasformata con un plasmide contenente un diverso membro della libreria delle varianti. Solo il gene di interesse differisce tra le cellule, mentre tutti gli altri geni vengono mantenuti uguali.
Le cellule esprimono la proteina sia nel loro citoplasma che nella loro superficie dove la sua funzione può essere testata. Questo formato ha il vantaggio di selezionare per le proprietà in un ambiente cellulare, che è utile quando la proteina evoluta o RNA deve essere utilizzato in organismi viventi.
Quando fatto senza cellule, DE utilizza la traduzione in vitro della trascrizione per produrre proteine o RNA libero in soluzione o all'interno di micro gocce artificiali. Questo ha il vantaggio di permettere più condizioni (ad esempio temperatura, solventi). Può esprimere proteine che sarebbero tossiche per le cellule. Inoltre, gli esperimenti di evoluzione in vitro possono generare biblioteche molto più grandi (fino a 1015) perché il DNA della biblioteca non deve essere inserito nelle cellule. Questo spesso limita ciò che può essere fatto.
Un esempio di evoluzione diretta rispetto all'evoluzione naturale. Il ciclo interno mostra le tre fasi del ciclo dell'evoluzione diretta con il processo naturale mimato tra parentesi. Il cerchio esterno mostra i passi di un tipico esperimento. I simboli rossi indicano varianti funzionali, i simboli chiari indicano varianti con funzione ridotta.
Garantire l'ereditarietà
Quando le proteine funzionali sono state isolate, è necessario che lo siano anche i loro geni, quindi è necessario un collegamento genotipo-fenotipo.
Questo può essere covalente, dove il gene mRNA è legato alla proteina alla fine della traduzione con la puromicina.
In alternativa la proteina e il suo gene possono essere tenuti insieme, o in gocce di emulsione. Le sequenze geniche isolate vengono poi moltiplicate per PCR o da batteri ospiti trasformati. Sia la singola sequenza migliore, o un pool di sequenze può essere utilizzato come modello per il prossimo ciclo di mutagenesi. I cicli ripetuti di diversificazione-selezione-amplificazione rendono le variazioni enzimatiche adattate al processo di selezione.
Una proteina espressa può essere covalentemente legata al suo gene (come nell'mRNA), a sinistra, o messa nello stesso scomparto con esso, a destra. In entrambi i casi il gene che codifica la proteina viene isolato
Premio assegnato
L'ingegnere statunitense Frances Arnold ha vinto il Millennium Technology Prize per l'evoluzione diretta pionieristica.
Domande e risposte
D: Che cos'è l'evoluzione diretta?
R: L'evoluzione diretta (DE) è un metodo utilizzato per produrre enzimi per scopi industriali o medici. Si tratta di una forma di ingegneria proteica che imita la selezione naturale.
D: Come funziona l'evoluzione diretta?
R: L'evoluzione diretta funziona sottoponendo un gene a ripetuti cicli di mutazioni, creando una libreria di varianti. La selezione isola poi i geni con la funzione desiderata, che vengono poi utilizzati come modelli per il ciclo successivo.
D: Dove si può fare l'evoluzione diretta?
R: L'evoluzione diretta può essere effettuata in vivo (in cellule viventi di batteri o lievito), o in vitro (in soluzione libera o in microgocce).
D: Quali sono i vantaggi dell'evoluzione diretta in vivo?
R: L'evoluzione diretta in vivo ha il vantaggio di selezionare le proprietà in un ambiente cellulare, il che è utile quando la proteina o l'RNA evoluto deve essere utilizzato negli organismi viventi.
D: Quali sono i vantaggi dell'evoluzione diretta in vitro?
R: L'evoluzione diretta in vitro ha il vantaggio di consentire un maggior numero di condizioni (ad esempio, temperatura, solventi) e può esprimere proteine che sarebbero tossiche per le cellule. Inoltre, può generare librerie molto più ampie, perché il DNA non deve essere inserito nelle cellule.
D: Cosa limita ciò che si può fare durante un esperimento in vitro?
R: Il limite dimensionale di ciò che si può fare durante un esperimento in vitro è spesso determinato dalla quantità di DNA che deve essere inserita nelle cellule.
