Nucleasi a dita di zinco
Le nucleasi a dita di zinco (o ZFN) sono uno strumento usato per colpire i geni e cambiare il DNA. È uno dei tre metodi per cambiare il genoma con le nucleasi ingegnerizzate.
Hanno due parti. Le dita di zinco sono molecole create dall'uomo fatte di una proteina e di zinco. Ciascuna si lega a un DNA specifico. Le nucleasi a dito di zinco (ZFN) sono enzimi ottenuti fondendo un dito di zinco con un enzima di scissione del DNA chiamato Fokl. Così la ZFN si lega ad una specifica sequenza di DNA, poi la taglia in due punti. Gli enzimi cellulari regolari attaccano le estremità insieme, meno la parte tagliata (riparazione del DNA).
Ogni ZFN è fatto per essere usato su un singolo gene che è chiamato "gene bersaglio" o "DNA bersaglio". Possono essere progettati per lavorare su parti specifiche di geni per creare un cambiamento desiderato. I due tipi di cambiamenti del DNA sono mutazioni come delezioni e inserzioni. La ricerca genetica guarda ai soggetti animali mutati per scoprire cosa fa quel particolare gene.
Rappresentazione 3-D di una molecola di dito di zinco. Le dita di zinco sono etichettate in blu e lo ione di zinco in verde.
Struttura del dito di zinco
"Zinc finger" è il nome di molte strutture proteiche. L'atomo di zinco lega le proteine e le rende più stabili. Le ZFN si legano alle coppie di basi del DNA. Un dito di zinco può legare circa 3 coppie di basi da solo.
Funzione ZFN
Le nucleasi a dita di zinco sono fatte con 3-6 dita di zinco. Le ZFN hanno due domini importanti: un dominio di legame al DNA e un dominio di clivaggio del DNA. Il dominio di DNA-cleavage utilizza un enzima chiamato Fokl che rompe il DNA.
Gli ZFN possono cambiare solo le sequenze di DNA per cui sono stati progettati. Il dominio di legame al DNA si lega a una specifica sequenza di DNA. Due ZFN progettati per la stessa sequenza di DNA sono necessari per cambiare un gene. I domini DNA-binding si legano a entrambi i filamenti della doppia elica del DNA. I domini DNA-cleaving rompono il filamento di DNA e tagliano le coppie di basi del gene. Le cellule riparano da sole i filamenti di DNA rotti usando la riparazione del DNA. Le mutazioni di delezione risultano da coppie di basi mancanti dopo la riparazione del DNA.
La lunghezza della sequenza del gene target può anche essere specificata. Un minimo di 9 paia di basi può essere cambiato usando 3 dita di zinco. Questo è utile per rimuovere e inserire sequenze di DNA molto corte e determinare il loro effetto sul gene bersaglio. Anche sequenze grandi possono essere cambiate usando più di una ZFN.
Uso di ZFN
Gli ZFN sono stati usati per scoprire le funzioni dei geni in molti studi di genetica. Gli ZFN possono essere usati per cambiare il DNA su qualsiasi specie. Un'altra caratteristica degli ZFN è che possono essere usati in vivo (in organismi viventi). Sono attualmente utilizzati su organismi modello: piante, insetti e pesci.
Una lista di organismi coinvolti nella ricerca sull'alterazione dei geni ZFN include:
- Arabidopsis
- Bestiame
- C. elegans
- Mais
- Drosophila melanogaster
- Rane
- Topi
- Maiali
- Conigli
- Ratti
- Ricci di mare
- Bachi da seta
- Soia
- Tabacco
- Zebrafish
Problemi con gli ZFN
Il più grande problema con gli ZFN è l'alterazione accidentale dei geni oltre al gene bersaglio. Un ZFN deve essere fatto per trovare le giuste coppie di basi sul gene bersaglio. Queste coppie di basi sono scelte in modo che solo il gene bersaglio le abbia. I domini di DNA-cleavage lavorano su qualsiasi sequenza di DNA, quindi legandosi a una sequenza di geni sbagliata la cambieranno invece. Gli ZFN che eliminano le coppie di basi per più di un gene non sono considerati accurati.
Domande e risposte
D: Che cos'è la nucleasi a dito di zinco o ZFN?
R: Le nucleasi a dito di zinco o ZFN sono uno strumento utilizzato per indirizzare i geni e modificare il DNA.
D: Quali sono i tre metodi per modificare il genoma con le nucleasi ingegnerizzate?
R: Le nucleasi a dito di zinco o ZFN, le nucleasi attivatrici di trascrizione (TALEN) e le ripetizioni palindromiche brevi intercalate (CRISPR) sono i tre metodi di modifica del genoma con le nucleasi ingegnerizzate.
D: Cosa sono le dita di zinco?
R: Le dita di zinco sono molecole create dall'uomo, composte da una proteina e da zinco, che si legano a un DNA specifico.
D: Cosa sono le nucleasi a dito di zinco (ZFN)?
R: Le nucleasi a dito di zinco (ZFN) sono enzimi che derivano dalla fusione di un dito di zinco con un enzima di clivaggio del DNA chiamato Fokl.
D: Cosa succede quando la ZFN si lega ad una sequenza specifica di DNA?
R: Quando lo ZFN si lega ad una sequenza specifica di DNA, la taglia in due punti.
D: Cosa fanno i normali enzimi cellulari dopo che il DNA è stato tagliato?
R: Gli enzimi cellulari regolari incollano le estremità, meno la parte tagliata (riparazione del DNA).
D: Quali sono i due tipi di modifiche al DNA che le nucleasi a dito di zinco o ZFN possono apportare?
R: Le nucleasi a dito di zinco o ZFN possono apportare due tipi di modifiche al DNA: mutazioni come delezioni e inserzioni.
