Nel 539 a.C., l'impero neo-babilonese cadde a Ciro il Grande, il re di
Persia, nella battaglia di Opis. Le mura di Babilonia erano molto alte e molto spesse. L'unico modo per entrare in città era attraverso una delle sue molte porte. L'Eufrate scorreva vicino alle mura e Ciro decise di usare il fiume per entrare in città. Le truppe di Ciro deviarono il fiume Eufrate. Questo fece scendere il livello del fiume permettendo ai soldati di entrare in città.
I Babilonesi avevano tenuto una festa quella sera. L'esercito persiano prese la maggior parte della città prima che i babilonesi si rendessero conto che i persiani erano entrati in città. Il racconto è stato riportato da Erodoto, ed è anche menzionato nella Bibbia ebraica. Ciro rivendicò la città camminando attraverso le porte di Babilonia con poca o nessuna resistenza da parte dei Babilonesi ubriachi.
Ciro in seguito emise un decreto che permetteva alle persone, compresi gli ebrei, di tornare nella loro terra. Questo è menzionato nell'Antico Testamento. Permise che il tempio degli ebrei fosse ricostruito a Gerusalemme.
Sotto Ciro e il successivo re persiano Dario il Grande, Babilonia divenne la capitale della IX Satrapia (Babilonia a sud e Athura a nord). Era un centro di apprendimento e progresso scientifico. Nella Persia achemenide, le arti babilonesi dell'astronomia e della matematica furono rivitalizzate. Gli studiosi babilonesi realizzarono mappe delle costellazioni. La città era la capitale amministrativa dell'impero persiano. Questo impero era il più potente del mondo allora conosciuto. Sono state fatte molte importanti scoperte archeologiche che migliorano la nostra comprensione di quell'epoca.
I primi re persiani avevano cercato di mantenere le cerimonie religiose di Marduk. Sotto il regno di Dario III, l'eccessiva tassazione e le numerose guerre avevano portato al deterioramento dei principali santuari e canali di Babilonia e alla disintegrazione della regione. Nonostante tre ribellioni nel 522 a.C., 521 a.C. e 482 a.C., la terra e la città di Babilonia rimasero sotto il dominio persiano per due secoli. Nel 331 a.C. Alessandro il Grande prese il controllo. Sotto l'impero partico, Babilonia continuò a ridursi e a perdere importanza.