Nel 1606 gli Smith furono ingaggiati dalla Virginia Company per stabilirsi nella colonia della Virginia a scopo di lucro. Salparono con tre navi nel dicembre 1606. Smith aveva un servo di nome Samuel Collier. Samuel Collier sarebbe rimasto accanto a lui per la maggior parte del viaggio.
Ci furono problemi durante il viaggio e Smith fu accusato di ammutinamento. Il capitano Newport progettò di giustiziarlo. Il capitano aprì una lettera di ordini della Virginia Company che affermava che Smith doveva essere uno dei leader della nuova colonia, così Smith non fu ucciso.
Gli inglesi arrivarono nell'aprile 1607 e il capitano Wingfield scelse Jamestown come sede della colonia. In estate i coloni vivevano ancora in alloggi temporanei. Dopo il viaggio di quattro mesi nell'oceano, le scorte di cibo erano sufficienti solo per una o due tazze di farina di grano al giorno per ogni persona. A causa del tempo e della mancanza di cibo le malattie si diffusero tra la gente e a settembre più della metà morì.
Nel dicembre 1607, Smith era alla ricerca di cibo e fu catturato dai nativi americani. Fu portato ad incontrare il capo della tribù Powhatan. Il villaggio era a circa 15 miglia da Jamestown. Smith fu rilasciato senza danni e il merito fu in parte della figlia del capo, Pocahontas, che si gettò sul suo corpo. Vedendo questo, suo padre ebbe pietà di Smith e fu riportato sano e salvo a Jamestown. Questo incontro iniziò una relazione amichevole tra i nativi, Smith e i coloni di Jamestown. All'inizio di gennaio 1608, quasi 100 nuovi coloni arrivarono con il capitano Newport, e per negligenza il villaggio fu incendiato. Quell'inverno il fiume James si ghiacciò e i coloni furono costretti a vivere nelle rovine. Durante questo periodo, Newport e il suo equipaggio persero molto tempo a caricare le loro navi con pirite di ferro (l'oro degli sciocchi). Le scorte di cibo si esaurirono e anche se i nativi americani portarono del cibo, Smith scrisse che "più della metà di noi morì".
Nell'aprile 1608 una nave portò rifornimenti e 50 nuovi coloni, che Smith mise a costruire abitazioni e a piantare colture.
Nell'estate del 1608, Smith lasciò Jamestown per esplorare la regione della Baia di Chesapeake e cercare il cibo di cui aveva estremo bisogno. Fece una mappa che sarebbe stata di grande valore per gli esploratori della Virginia per oltre un secolo. In sua assenza, Smith lasciò il suo amico Matthew Scrivener, come governatore al suo posto. Scrivener sarebbe poi annegato in una tempesta in uno sfortunato viaggio verso Hog Island. Smith fu eletto presidente del consiglio locale nel settembre 1608 e istituì regole severe.
Nell'ottobre 1608, una nave arrivò con 70 nuovi coloni, comprese le prime donne. Arrivarono anche alcuni artigiani tedeschi e polacchi, ma non portarono cibo. In seguito, Smith cercò di ottenere cibo dai nativi americani e ci vollero minacce di forza militare per farli obbedire. Powhatan era spaventato dal gran numero di uomini bianchi che arrivavano nella zona e cercava di farli morire di fame.
Smith scoprì che c'era qualcuno, sia tra i coloni che tra i nativi americani, a cui non piacevano le sue regole e che avevano intenzione di ucciderlo. Smith scrisse di essere stato avvertito da Pocahontas. Convocò una riunione e disse agli uomini che non lavoravano che "chi non lavora non mangia...". Dopo di che la situazione migliorò.
Per tre mesi all'inizio del 1609, febbraio, marzo e aprile, tutto andava bene a Jamestown, con molte abitazioni costruite, acri di terra ripuliti e molto altro lavoro fatto. Poi in aprile, i topi e l'umidità distrussero tutto il loro grano immagazzinato. Avevano un gran bisogno di cibo e Smith mandò un grande gruppo di coloni a pescare e altri a raccogliere molluschi lungo il fiume. Tornarono senza cibo ed erano abbastanza disposti a prendere le misere razioni offerte loro. Questo fece arrabbiare Smith che ordinò loro di scambiare le loro pistole e gli attrezzi con la frutta degli indiani e ordinò a tutti di lavorare o avrebbero dovuto lasciare la sicurezza del forte. Alcuni partirono e andarono nei villaggi dei nativi americani, ma anche la gente di Powhatan seguì la legge di Smith che chi non lavora, non mangia. Questo rimase in vigore fino a quando non furono quasi morti di fame e tornarono a casa.
Ad un certo punto arrivò una nave inaspettata, capitanata da Samuel Argall. Aveva cibo e vino che Smith comprò con la promessa di ripagarlo. Argall portò anche la notizia che la Virginia Company stava inviando altri rifornimenti e coloni a Jamestown insieme a un nuovo governatore, Lord De la Warr.
In un viaggio del maggio 1609 verso la Virginia, Sir Thomas Smith, tesoriere della Virginia Company, organizzò l'arrivo di circa 500 coloni, tra cui donne e bambini. Una flotta di nove navi salpò. Una affondò in una tempesta poco dopo aver lasciato il porto. La Sea Venture naufragò nelle isole Bermuda con a bordo l'ammiraglio e Stephen Hopkins. Un anno dopo, nel maggio 1610, erano arrivati a Jamestown in piccole barche che avevano costruito. Gates scoprì presto che non c'era abbastanza cibo per sostenere tutti nella colonia e decise di abbandonare Jamestown. Mentre le loro barche stavano lasciando la zona di Jamestown, incontrarono una nave che trasportava il nuovo governatore, Lord De la Warr, che ordinò loro di tornare a Jamestown.
Nell'agosto 1609 John Smith fu abbastanza sorpreso di vedere arrivare più di 300 nuovi coloni. Londra stava inviando nuovi coloni senza alcuna pianificazione su come e dove avrebbero vissuto.
Il capitano John Smith fu gravemente ferito da un'esplosione accidentale di polvere da sparo nella sua canoa. Smith salpò per l'Inghilterra per essere curato nell'ottobre 1609. Aveva trascorso due anni e mezzo cercando di fare del suo meglio per Jamestown. Non tornò mai più in Virginia. La storia ha confermato il suo grande contributo a Jamestown nei suoi primi anni.
I coloni avrebbero continuato a morire per varie malattie e disturbi, con una stima di 150 dei 500 sopravvissuti quell'inverno. Nonostante questo, la Virginia Company continuò a finanziare e trasportare coloni per sostenere Jamestown. Per i successivi cinque anni, i governatori Gates e Sir Thomas Dale continuarono a mantenere una rigida disciplina, con Sir Thomas Smith a Londra che cercava di trovare artigiani qualificati e altri coloni da inviare a Jamestown.
