Nel 1936, Indiana Jones sta cercando di trovare l'idolo d'oro nella giungla del Perù. La sua guida, Sapito, lo tradisce e cerca di prendere l'idolo per sé, ma viene ucciso in una delle trappole. Dopo che Jones esce dal tempio, trova il suo rivale Belloq e una dozzina di indigeni con le lance in mano. Jones rinuncia all'idolo e corre verso il suo aereo.
Mentre insegna al Marshall College, l'esercito degli Stati Uniti viene da lui e gli dice che i nazisti stanno cercando di trovare l'Arca dell'Alleanza. Jones vuole trovarla per primo, così va in un bar in Nepal. Il suo vecchio insegnante, Abner Ravenwood, stava cercando di trovare l'Arca e ha il copricapo del Bastone di Ra, un pezzo importante che è necessario per trovarla. Sua figlia, Marion, ora gestisce il bar di Abner e lo prende a pugni in faccia perché hanno avuto una storia d'amore e lui è scappato. Lei, però, viene con lui dopo che il nazista Toht e i suoi amici cercano di ottenere il pezzo da soli.
Jones e Ravenwood volano al Cairo e reclutano un uomo di nome Sallah per aiutarlo. Iniziano a scavare nella zona dove pensano che sia. I nazisti catturano Ravenwood e fanno credere a Jones che sia morta. Sallah e Jones fanno alcuni calcoli e si rendono conto che i nazisti stanno scavando nella zona sbagliata perché il loro bastone è troppo lungo. Jones trova il posto giusto e inizia a scavare, trovandolo in un posto chiamato il Pozzo delle Anime. Tuttavia, Belloq torna, solleva l'Arca e ci getta Ravenwood. I due fuggono.
Dopo una battaglia, Jones recupera l'Arca. Sallah la mette su una nave, ma i nazisti su un U-boat intercettano la nave e la perquisiscono. Jones fugge. Poi prende una grande arma chiamata Panzerschreck e minaccia di far saltare l'Arca mentre viene caricata su un'isola. Belloq chiama il bluff di Jones e Jones abbassa l'arma. Lui e Marion sono poi legati mentre Belloq e i nazisti testano il potere dell'Arca aprendola. Gli spiriti all'interno uccidono tutti. Jones e Marion chiudono gli occhi e sfuggono alla rabbia degli spiriti.
Alla fine del film, il governo mette l'Arca in un magazzino. L'esercito dice a Jones che la stanno studiando, ma Jones non gli crede. Marion cerca di confortarlo dicendo che gli offrirà da bere.
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