Gascromatografia-spettrometria di massa

Storia

I primi lavori di ricerca sulla cromatografia gas-liquido sono stati pubblicati nel 1950. I chimici usavano diversi rivelatori per vedere che i composti uscivano dalla fine del cromatografo. La maggior parte dei rivelatori distrussero i composti, perché li bruciavano o li ionizzavano. Questi rivelatori hanno lasciato i chimici indovinare l'identità esatta di ogni composto nel campione. Negli anni '50, Roland Gohlke e Fred McLafferty svilupparono una nuova macchina combinata. Usarono uno spettrometro di massa come rivelatore in gascromatografia. Questi primi apparecchi erano grandi, fragili e originariamente limitati alle impostazioni di laboratorio.

Il progetto era complesso. L'intervallo di tempo tra i diversi composti che fluiscono fuori dal cromatografo era difficile da controllare. Così, lo spettrometro di massa doveva finire di lavorare su un composto prima che quello successivo uscisse dal cromatografo. Nei primi modelli, le misurazioni dello spettrometro di massa venivano registrate su carta millimetrata. I chimici altamente addestrati studiavano i modelli dei picchi per identificare ogni composto. Negli anni '70, sono stati aggiunti agli spettrometri di massa convertitori analogico-digitali. Questo permetteva ai computer di memorizzare e interpretare i risultati. Man mano che i computer crescevano sempre più velocemente e si riducevano, il GC-MS diventava più veloce e si diffondeva dai laboratori alla vita di tutti i giorni. Oggi, gli strumenti GC-MS computerizzati sono ampiamente utilizzati nel monitoraggio ambientale di acqua, aria e suolo. Viene anche utilizzato nella regolamentazione dell'agricoltura, nella sicurezza alimentare e nella scoperta e produzione di medicinali.

Lo sviluppo di piccoli computer ha contribuito alla semplificazione delle macchine GC-MS. Ha anche ridotto notevolmente il tempo necessario per analizzare un campione. Electronic Associates, Inc. (EAI) era un fornitore leader negli Stati Uniti di computer analogici. Nel 1964, l'EAI iniziò lo sviluppo di uno spettrometro di massa controllato da computer sotto la direzione di Robert E. Finnigan. Nel 1966 furono venduti oltre 500 strumenti per l'analisi dei gas. Nel 1967 fu costituita la Finnigan Instrument Corporation (FIC). All'inizio del 1968, consegnò il primo prototipo di strumenti quadrapolari GC-MS a Stanford e alla Purdue University. La FIC fu infine rinominata Finnigan Corporation e si affermò come leader mondiale nei sistemi GC-MS.

Funzionamento di base

GC-MS può trovare tutti i composti mescolati insieme in un oggetto campione. L'operatore scioglie il campione in un liquido. L'operatore inietta poi il liquido in un flusso di gas. (Elio, Idrogeno o Azoto sono usati più spesso.) Il gas scorre attraverso un tubo con un rivestimento speciale. Poiché ogni composto nel campione si attacca al rivestimento in modo diverso, ogni composto esce dal tubo in un momento diverso. Così il rivestimento viene usato per separare ogni composto che è stato mescolato insieme nel campione. Poiché ogni composto esce all'estremità della provetta, è ionizzato e riceve una carica elettrica. La maggior parte dei composti si rompe quando sono ionizzati. I diversi pezzi volano sotto un magnete che separa i pezzi in base al loro peso e alla loro carica. Un computer misura poi tutti i pezzi di ogni composto. Confrontando le misure con una libreria di composti noti, il computer fa un elenco dei nomi di tutti i composti del campione. Il computer può anche dire quanto di ogni composto era presente nel campione.

Strumentazione

Il GC-MS è costituito da due grandi blocchi: il gascromatografo e lo spettrometro di massa. Il gascromatografo utilizza una colonna capillare che dipende dalle dimensioni della colonna (lunghezza, diametro, spessore del film) e dalle proprietà della fase (ad es. 5% di polisilossano fenilico). La differenza nelle proprietà chimiche tra le diverse molecole di una miscela separerà le molecole mentre il campione percorre la lunghezza della colonna. Le molecole impiegano diverse quantità di tempo (chiamato tempo di ritenzione) per uscire dal gascromatografo. Questo permette allo spettrometro di massa a valle di catturare, ionizzare, accelerare, deviare e rilevare le molecole ionizzate separatamente. Lo spettrometro di massa fa questo rompendo ogni molecola in frammenti ionizzati e rilevando questi frammenti utilizzando il loro rapporto massa/carica.

Queste due macchine, utilizzate insieme, consentono una precisione di identificazione della sostanza molto più fine rispetto alle due unità utilizzate separatamente. Non è possibile effettuare un'identificazione accurata di una particolare molecola con la sola gascromatografia o la spettrometria di massa. Il processo di spettrometria di massa richiede normalmente un campione molto puro. In passato, la gascromatografia utilizzava altri rivelatori come il rivelatore a ionizzazione di fiamma. Questi rivelatori non possono separare molecole diverse che richiedono lo stesso tempo per viaggiare attraverso la colonna. (Quando due molecole diverse hanno lo stesso tempo di ritenzione, si dice che sono "co-elute"). Le molecole coelettanti confonderanno i programmi del computer che stanno leggendo un singolo spettro di massa per entrambe le molecole.

A volte due molecole diverse possono anche avere un modello simile di frammenti ionizzati in uno spettrometro di massa (spettro di massa). La combinazione dei due processi riduce la possibilità di errore. È estremamente improbabile che due molecole diverse si comportino allo stesso modo sia in un gascromatografo che in uno spettrometro di massa. Pertanto, se uno spettro di massa corrisponde all'analita di interesse, il tempo di ritenzione di tale spettro può essere controllato rispetto ad un tempo di ritenzione GC caratteristico per aumentare la fiducia che l'analita si trova nel campione.

Tipi di rilevatori dello spettrometro di massa

Il tipo più comune di SM associato ad un GC è lo spettrometro di massa a quadrupolo. Hewlett-Packard (ora Agilent) lo commercializza con il nome commerciale "Mass Selective Detector" (MSD). Un altro rivelatore relativamente comune è lo spettrometro di massa a trappola ionica. Inoltre si può trovare uno spettrometro di massa a settori magnetici. Tuttavia questi particolari strumenti sono costosi e ingombranti e non si trovano tipicamente nei laboratori di servizio ad alta produttività. Altri rivelatori sono utilizzati come il tempo di volo (TOF), i quadrupoli tandem (MS-MS) (vedi sotto), o nel caso di una trappola ionica MSn. La n indica il numero di fasi della spettrometria di massa.

L'interno del GC-MS, con la colonna del gascromatografo nel forno a destra.


Schema GC-MS

Analisi

Uno spettrometro di massa è tipicamente usato in uno dei due modi: Scansione completa o monitoraggio ionico selettivo (SIM). Il tipico GC-MS può funzionare in entrambi i modi da solo, o entrambi allo stesso tempo.

Scansione completa MS

Quando si raccolgono i dati nella modalità di scansione completa, viene selezionato un intervallo target di frammenti di massa da inserire nel metodo dello strumento. Un esempio di un tipico ampio range di frammenti di massa da monitorare sarebbe m/z 50 a m/z 400. La determinazione di quale intervallo utilizzare è in gran parte determinata da ciò che ci si aspetta di trovare nel campione, pur essendo consapevoli del solvente e di altre possibili interferenze. Se una SM cerca frammenti di massa con un m/z molto basso, può rilevare l'aria o altri possibili fattori di interferenza. L'utilizzo di un ampio range di scansione diminuisce la sensibilità dello strumento. La macchina eseguirà meno scansioni al secondo perché ogni scansione richiederà più tempo per rilevare una gamma più ampia di frammenti di massa.

La scansione completa è utile per determinare i composti sconosciuti in un campione. Fornisce più informazioni della SIM quando si tratta di confermare o risolvere i composti in un campione. La maggior parte degli strumenti sono controllati da un computer che gestisce un programma per computer chiamato "metodo dello strumento". Il metodo strumentale controlla la temperatura nel GC, la velocità di scansione MS e la gamma delle dimensioni dei frammenti rilevati. Quando un chimico sta sviluppando un metodo strumentale, il chimico invia le soluzioni di prova attraverso il GS-MS in modalità di scansione completa. Questo controlla il tempo di ritenzione del GC e l'impronta del frammento di massa prima di passare ad un metodo strumentale SIM. Gli strumenti GC-MS specializzati, come i rivelatori di esplosivi, hanno un metodo strumentale precaricato in fabbrica.

Monitoraggio ionico selezionato

Nel monitoraggio ionico selezionato (SIM), il metodo dello strumento si concentra su alcuni frammenti di ioni. Solo questi frammenti di massa vengono rilevati dallo spettrometro di massa. Il vantaggio del SIM è che il limite di rilevazione è più basso, poiché lo strumento guarda solo un piccolo numero di frammenti (ad es. tre frammenti) durante ogni scansione. Ogni secondo possono essere effettuate più scansioni. Poiché vengono monitorati solo pochi frammenti di massa di interesse, le interferenze della matrice sono tipicamente più basse. Per migliorare le possibilità di leggere correttamente un risultato positivo, i rapporti ionici dei vari frammenti di massa sono paragonabili ad uno standard di riferimento noto.

Tipi di ionizzazione

Dopo che le molecole percorrono la lunghezza della colonna, passano attraverso la linea di trasferimento ed entrano nello spettrometro di massa e vengono ionizzate con vari metodi. In genere si usa un solo metodo di ionizzazione in un dato momento. Una volta che il campione è frammentato sarà poi rilevato, di solito da un diodo moltiplicatore di elettroni. Il diodo tratta il frammento di massa ionizzata come un segnale elettrico che viene poi rilevato.

I chimici selezionano una tecnica di ionizzazione separatamente dalla scelta della scansione completa o del monitoraggio della SIM.

Ionizzazione elettronica

Il tipo di ionizzazione più comune è la ionizzazione elettronica (EI). Le molecole entrano nella MS (la sorgente è un quadrupolo o la trappola ionica stessa in una trappola ionica MS) dove vengono colpite con elettroni liberi emessi da un filamento. Questo è come il filamento che si trova in una lampadina a incandescenza standard. Gli elettroni colpiscono le molecole, causando la frammentazione della molecola in un modo caratteristico che può essere ripetuto. Questa tecnica di "ionizzazione dura" porta alla creazione di più frammenti di basso rapporto massa/carica (m/z). L'EI ha pochi, se non nessuno, frammenti con una massa che è vicina alla massa della molecola originale. I chimici ritengono che la ionizzazione dura spari elettroni nelle molecole del campione. Al contrario, la "ionizzazione morbida" consiste nel mettere una carica sulla molecola del campione colpendola con un gas introdotto. Il modello di frammentazione molecolare dipende dall'energia degli elettroni applicata al sistema, tipicamente 70 eV (elettronvolt). L'uso di 70 eV aiuta a confrontare gli spettri generati dal campione di prova con gli spettri noti della biblioteca. (Gli spettri della biblioteca possono provenire da software forniti dal produttore o da software sviluppato dal National Institute of Standards (NIST-USA)). Il software ricerca gli spettri della libreria utilizzando un algoritmo di corrispondenza come Probability Based Matching o dot-product matching. Molte agenzie di standardizzazione dei metodi controllano ora questi algoritmi e metodi per assicurare la loro obiettività.

Ionizzazione chimica

Nella ionizzazione chimica (CI), un gas reagente, tipicamente metano o ammoniaca, viene messo nello spettrometro di massa. Ci sono due tipi di CI: CI positivo o negativo. In entrambi i casi, il gas reagente interagisce con gli elettroni e l'analita e causa una ionizzazione "morbida" della molecola di interesse. Una ionizzazione più morbida frammenta la molecola ad un grado inferiore rispetto alla ionizzazione dura dell'EI. I chimici preferiscono l'IC rispetto all'EI. Questo perché l'IC produce almeno un frammento di massa con un peso, che è quasi uguale al peso molecolare dell'analita di interesse.

Ionizzazione chimica positiva

Nella ionizzazione chimica positiva (PCI) il gas reagente interagisce con la molecola bersaglio, il più delle volte con uno scambio di protoni. Questo produce la specie ionica in quantità relativamente elevate.

Ionizzazione chimica negativa

Nella ionizzazione chimica negativa (NCI) il gas reagente diminuisce l'impatto degli elettroni liberi sull'analita bersaglio. Questa diminuzione di energia lascia tipicamente il frammento in grande quantità. (I frammenti non si rompono ulteriormente).

Interpretazione

L'obiettivo primario dell'analisi strumentale è quello di misurare una quantità di sostanza. Ciò viene fatto confrontando le concentrazioni relative tra le masse atomiche nello spettro di massa generato. Sono possibili due tipi di analisi, comparativa e originale. L'analisi comparativa confronta essenzialmente lo spettro dato con una libreria di spettro per vedere se le sue caratteristiche sono presenti per qualche campione noto nella libreria. Questo viene eseguito al meglio da un computer perché ci sono molte distorsioni visive che possono verificarsi a causa delle variazioni di scala. I computer possono anche correlare più dati (come i tempi di conservazione identificati dal GC), per mettere in relazione più accuratamente alcuni dati.

Un altro metodo di analisi misura i picchi in relazione l'uno all'altro. In questo metodo, il picco più alto è impostato al 100%. Agli altri picchi viene dato un valore pari al rapporto tra l'altezza del picco e l'altezza del picco più alto. Tutti i valori superiori al 3% sono assegnati. La massa totale del composto sconosciuto viene normalmente indicata dal picco genitore. Il valore di questo picco genitore può essere utilizzato per adattarsi ad una formula chimica contenente i vari elementi che si ritiene siano presenti nel composto. Lo schema isotopico nello spettro è unico per gli elementi che hanno molti isotopi. Quindi, può anche essere usato per identificare i vari elementi presenti. Questo indica la formula chimica complessiva della molecola sconosciuta. Poiché la struttura e i legami di una molecola si rompono in modi caratteristici, essi possono essere identificati dalla differenza delle masse di picco. La struttura molecolare identificata deve essere coerente con le caratteristiche registrate da GC-MS. In genere, questa identificazione viene effettuata automaticamente dai programmi per computer forniti con lo strumento. Questi programmi confrontano gli spettri con una libreria di composti noti che hanno la stessa lista di elementi che potrebbero essere presenti nel campione.

Un'analisi a "spettro completo" considera tutti i "picchi" all'interno di uno spettro. Ma il monitoraggio selettivo degli ioni (SIM) monitora solo i picchi selezionati associati ad una specifica sostanza. I chimici suppongono che ad un dato tempo di ritenzione, un insieme di ioni sia caratteristico di un certo composto. La SIM è un'analisi veloce ed efficiente. La SIM funziona meglio quando l'analista ha informazioni precedenti su un campione o sta cercando solo alcune sostanze specifiche. Quando la quantità di informazioni raccolte sugli ioni in un determinato picco gascromatografico diminuisce, la sensibilità dell'analisi aumenta. Quindi, l'analisi SIM consente di rilevare e misurare una quantità minore di un composto. Ma il grado di certezza sull'identità di quel composto si riduce.

GC-tandem MS

Quando si aggiunge una seconda fase di frammentazione di massa, ad esempio utilizzando un secondo quadrupolo in uno strumento a quadrupolo, si chiama tandem MS (MS/MS). Gli MS/MS sono bravi a misurare bassi livelli di composti target in un campione con una matrice di composti di fondo che non sono di interesse.

Il primo quadrupolo (Q1) è collegato con una cella di collisione (q2) e un altro quadrupolo (Q3). Entrambi i quadrupoli possono essere utilizzati in modalità di scansione o statica, a seconda del tipo di analisi MS/MS utilizzata. I tipi di analisi includono la scansione ionica del prodotto, la scansione ionica del precursore, il monitoraggio della reazione selezionata (SRM) e la scansione della perdita neutra. Per esempio: Quando il Q1 è in modalità statica (guardando una sola massa come nella SIM), e il Q3 è in modalità di scansione, si ottiene un cosiddetto spettro ionico di prodotto (chiamato anche "spettro figlia"). Da questo spettro, si può selezionare uno ione prodotto prominente che può essere lo ione prodotto per lo ione precursore scelto. La coppia è chiamata "transizione" e costituisce la base per gli SRM. SRM è altamente specifico ed elimina quasi completamente lo sfondo della matrice.

Applicazioni

Monitoraggio ambientale e pulizia

Molti chimici ritengono che il GC-MS sia il miglior strumento per il monitoraggio degli inquinanti organici nell'ambiente. Il costo delle apparecchiature GC-MS è diminuito molto. L'affidabilità del GC-MS è aumentata allo stesso tempo. Entrambi i miglioramenti hanno aumentato l'uso negli studi ambientali. Alcuni composti, come alcuni pesticidi ed erbicidi, non possono essere identificati dal GS-MS. Sono troppo simili ad altri composti correlati. Ma per la maggior parte delle analisi organiche dei campioni ambientali, comprese molte classi principali di pesticidi, il GC-MS è molto sensibile ed efficace.

Criminal forensics

GC-MS può analizzare le particelle di un corpo umano per aiutare a collegare un criminale a un crimine. La legge accetta l'uso del GC-MS per analizzare i residui del fuoco. Infatti, l'American Society for Testing Materials (ASTM) ha uno standard per l'analisi dei detriti da incendio. GCMS/MS è particolarmente utile in questo caso in quanto i campioni spesso contengono matrici molto complesse e i risultati, utilizzati in tribunale, devono essere altamente accurati.

Applicazione della legge

Il GC-MS è utilizzato per l'individuazione di sostanze stupefacenti illegali e può eventualmente sostituire i cani antidroga. È anche comunemente usato in tossicologia forense. Aiuta a trovare droghe e/o veleni in campioni biologici prelevati da sospetti, vittime o cadaveri.

Sicurezza

Dopo gli attentati terroristici dell'11 settembre 2001, i sistemi di rilevamento degli esplosivi sono entrati a far parte di tutti gli aeroporti statunitensi. Questi sistemi funzionano con una serie di tecnologie, molte delle quali basate su GC-MS. Ci sono solo tre produttori certificati dalla FAA per fornire questi sistemi. Il primo è Thermo Detection (ex Thermedics), che produce l'EGIS, una linea di rivelatori di esplosivi basata su GC-MS. Il secondo è Barringer Technologies, che ora è di proprietà della Smith's Detection Systems. Il terzo è Ion Track Instruments (parte della General Electric Infrastructure Security Systems).

Analisi di alimenti, bevande e profumi

Gli alimenti e le bevande contengono molti composti aromatici, alcuni naturalmente presenti nelle materie prime e altri che si formano durante la lavorazione. GC-MS è ampiamente utilizzato per l'analisi di questi composti che includono esteri, acidi grassi, alcoli, aldeidi, aldeidi, terpeni, ecc. Viene anche utilizzato per rilevare e misurare i contaminanti da deterioramento o adulterazione che possono essere dannosi. I contaminanti sono spesso controllati da agenzie governative, ad esempio i pesticidi.

Astrochimica

Diversi GC-MS hanno lasciato la terra. Due sono andati su Marte nel programma Viking. Venera 11 e 12 e Venere Pioniere Venere hanno analizzato l'atmosfera di Venere con il GC-MS. La sonda Huygens della missione Cassini-Huygens ha fatto atterrare un GC-MS sulla luna più grande di Saturno, Titano. Il materiale nella cometa 67P/Churyumov-Gerasimenko sarà analizzato dalla missione Rosetta con un GC-MS chirale nel 2014.

Medicina

I GC-MS sono utilizzati nei test di screening per neonati. Questi test possono trovare decine di malattie metaboliche congenite (note anche come errore innato del metabolismo). Il GC-MS può determinare i composti nelle urine anche in quantità molto piccole. Questi composti normalmente non sono presenti, ma compaiono in individui che soffrono di disturbi metabolici. Questo sta diventando un modo comune di diagnosticare l'IEM per una diagnosi precoce e per l'inizio del trattamento. Questo alla fine porta ad un risultato migliore. Ora è possibile testare un neonato per oltre 100 disturbi metabolici genetici con un test delle urine alla nascita basato sulla GC-MS.

In combinazione con l'etichettatura isotopica dei composti metabolici, il GC-MS viene utilizzato per determinare l'attività metabolica. La maggior parte delle applicazioni si basa sull'uso di ^13C come etichettatura e sulla misurazione dei rapporti ^13C-12C con uno spettrometro di massa a rapporto isotopico (IRMS). Un IRMS è uno spettrometro di massa con un rivelatore progettato per misurare alcuni ioni selezionati e valori di ritorno come rapporti.